逐光IsCMOS像增强相机助力荧光标记聚苯乙烯纳米粒子的高灵敏度实时光学成像
中国人民大学化学系张宇航博士借助中智科仪自主研发IsCMOS像增强相机，近期以：“Daphnia magna uptake and excretion of luminescence-labelled polystyrene nanoparticle as visualized by high sensitivity real-time optical imaging”为题发表在 “Chemosphere” 杂志上。
1、应用背景
塑料污染已经导致了严重的环境污染问题，每年大量的海洋生物例如海龟、鱼类、甲壳类生物因为误食塑料或者被渔业活动产生的垃圾如渔网、锚线缠绕而死亡。珊瑚礁系统是多种生物赖以生存的栖息地，近年来除了气候变化、水体酸化导致的影响，塑料污染也成为珊瑚面对的又一严峻考验，来自加州科学院等多个机构评估了全球多个地方的珊瑚礁，在全部的珊瑚礁都发现了塑料制品和人造材料的存在1。此前，来自美国国家标准与技术研究院(NIST)的化学家Christopher Zangmeister团队开展的一项新研究，通过热水浸泡一次性咖啡杯，在500 mL的体积内发现竟能产生5亿个塑料碎片2。加拿大的Kieran D. Cox教授和他的团队以美国人饮食为基础，根据食物消费种类以及不同种类食物所含有的微塑料数量，估算出每人每年会吃掉5万个微塑料颗粒，如果算上悬浮在空气中、被呼吸吸入的微塑料，那么每人每年吃掉的微塑料颗粒数量在7.4万-12.1万之间3。南京大学和南京医科大学合作的一项前瞻性研究表明消化道炎症与患者粪便中的微塑料颗粒数目具有相关性，并且消化道炎症会导致微塑料在消化道停留更长的时间4。宏观的塑料在使用过程中会逐渐崩解为细小的微米颗粒(<5 mm)以及纳米颗粒(<1 μm)，这些小颗粒已经被证明会对哺乳动物、鱼类、植物造成一系列的损伤，进入生物体内的塑料纳米颗粒已被报道会进入细胞中，产生活性氧甚至直接干扰遗传物质的复制过程。有研究团队已经证实，塑料颗粒的毒性与粒径成反比，粒径越小，对生物体造成的毒性越强5。然而纳米塑料与生态系统间的相互作用仍有相当多的空白，尤其是覆盖地球70%以上的复杂水生环境。
评估纳米塑料对水生生物的影响，其中一些关键信息是纳米塑料在生物体内的分布情况，排泄路径，载带能力。为了研究纳米塑料如何被生物摄取，分布在哪些组织器官中，并最终如何排出。通常使用的策略是用荧光染料、同位素、稀有金属等标记物标记纳米塑料，通过光学和元素分析的手段进行定性和定量分析。荧光染料掺杂的塑料纳米球很容易使用荧光显微镜进行观察，但是由于容易泄露，经常会得到一些假阳性结果。同位素和金属标记的方式很难做到实时原位活体的观察上述过程。由于光学检测具有实时原位活体检测的能力，其最大制约因素就是如何提高准确性和灵敏度。基于课题组在稀土掺杂上转换纳米材料的经验，开发了基于稀土掺杂上转换纳米材料的时间门控成像设备，并成功应用于观察水生小动物的实时摄取、累积和排出过程，具有较高的检测灵敏度的和优异的检出限。
稀土掺杂上转换纳米材料是一类以氟化物为基质的无机晶体，常见的NaYF4, NaGdF4和NaLuF4均可作为优良的发光材料基质，通过发光中心Er，Tm和Ho和敏化及剂Yb，Nd等离子的掺杂，稀土上转换纳米晶可以吸收较短波长的发光而发射出较长波长的光子，这一过程成为上转换过程。由于稀土离子的发光是宇称禁阻跃迁的，基质材料造成的配位场对称性破缺导致选律松动，稀土上转换材料的发光通常在亚毫秒量级，其发光寿命要比荧光分子的发光寿命小三个数量级，因此是作为时间分辨成像标记的优异材料。使用光学参量振荡器产生的974 nm (7ns, 100 Hz@10mJ)作为激发光光源，通过时序控制IsCMOS像增强相机的延时，可以有效去除生物体系的自体荧光和激发光干扰。本工作研究了一种水生滤食性动物大型蚤(D. magna)作为模式生物，通过构建的时间门控成像设备实现了高灵敏度、实时、原位活体检测纳米材料被生物体摄取、累积和排出的过程。
2、实验与方案
图1 时间门控成像设备示意图。a, 光学参量振荡器产生了974 nm (7 ns, 10 mJ)激光脉冲，通过整形透镜组激发样品，同步信号用以出发IsCMOS像增强相机。td和tg 被设置为3 μs和1 ms以实现最优的信号采集占空比。时间分辨图像通过正置显微镜系统采集并被IsCMOS采集。b, 时间门控成像时序示意图。蓝色，橙色和绿色图像分别代表了激发光、可能的自体荧光和上转换发光信号
时间门控成像设备主要由脉冲激光器、显微镜系统和中智科仪相机三部分组成，通过调节延时td，即激发光和采集信号的间隔时间，IsCMOS像增强相机仅采集了稀土离子的长寿命发光，这样可以避免生物自体荧光的干扰，由于IsCMOS像增强相机的单光子探测能力，信噪比也大大提高了。
图2，a, 表面包覆聚苯乙烯层的稀土上转换纳米颗粒扫描电镜图。右附图：动态光散射测定的纳米颗粒粒径。b, 稀土上转换纳米颗粒的扫描电镜图。c, 表面包覆聚苯乙烯层的稀土上转换纳米颗粒透射电镜图。d, 稀土发光纳米颗粒在980nm 连续激光激发下的光谱(2 W/cm2)。e，基于透射电镜的粒径统计。f，发光动力学。g，发光照片。
稀土发光纳米材料的粒径约为50 nm，其发光寿命长达亚毫秒量级，通过原位光聚合的方法在其表面包覆上一层聚苯乙烯纳米层，可以模拟自然界中发现的塑料纳米颗粒。将带有发光标记的纳米塑料喂食给大型蚤，可以事实原位活体观察其摄取过程。
图3. a-c, 明场条件, 激光开启时非门控模式和门控模式采集到的大型蚤图像(没有喂食塑料发光探针)。d-f, 喂食50 ng/mL 塑料发光探针24 h后的大水蚤个体，左至右分别为明场，非门控模式和门控模式下采集到的图片。
为了验证时间门控设备去除生物自体荧光和激光干扰的能力，我们设置了两组成像实验：体内不含有发光标记的对照组和喂食发光塑料的实验组，并通过是否设置延时来模拟有无门控条件下的成像质量。如图3所示，当空白对照组在非门控模式下采集图像，激光干扰造成的背景非常强，生物体的轮廓均有明显的发光信号，如果这样进行数据采集，将引入假阳性结果。但是开启门控功能后，背景看不到任何发光，证明了时间门控成像的可行性。我们进一步采集了暴露于发光标记纳米塑料的大型蚤图像，在非门控模式下，不仅在消化道内发现了大量的信号，在甲壳上也有明显的轮廓，当开启时间门控功能后，其甲壳上的发光消失，仅在消化道区域发现了信号。这一实验证明如果仅通过稳态发光来采集上转换信号，会同时收集到激光干扰和可能的生物自体荧光，时间门控的引入提高了检测的准确度。
通过时间门控成像采集到的图像，计算灰度值强度，通过外标法测定已知质量的纳米塑料，就可以测定大水蚤体内含有的塑料纳米颗粒质量。我们观察了在接近环境浓度的塑料纳米颗粒存在下大型蚤对其摄取的动力学过程，发现大型蚤作为一种滤食性动物具有很强的摄取和富集纳米塑料的能力，在10 min左右时间即可摄取3 ng左右的纳米塑料，更慢的累积过程揭示了纳米塑料具有持续在生物体内累积的潜力。
图4 大型蚤暴露于500 μg/L 的发光塑料标记24h的摄取和排出动力学过程
图4中每个数据点代表5只大水蚤体内塑料质量的平均值，蓝色区域代表数据的误差。摄取过程和排出过程采用双指数函数拟合。发光标记塑料质量通过时间门控成像设备和外标法测得。
图 5 a–h, 大型蚤暴露于500 μg/L发光纳米塑料下24 h的明场和时间门控图像
借助高灵敏度的时间门控成像设备，我们观察到了大型蚤摄取纳米塑料的完整过程。如图5所示，大型蚤体内的塑料首先富集在消化道内，若干小时后，发现其出现在甲壳上，表明很可能纳米塑料穿过了消化道细胞进入组织内。我们将实验的大型蚤进行了超薄切片并通过透射电子显微镜进行了观察。如图6所示，在大型蚤的甲壳内部发现纳米塑料，表明纳米塑料已经进入了循环系统并累计在甲壳内部，这与时间门控采集到的图像是一致的。消化道内发现了大量的塑料纳米颗粒，图6 d-f表明纳米塑料进入了消化道上皮细胞。这一发现表明纳米塑料对生物体造成的影响很可能直接作用于细胞内，需要一步进行探究纳米塑料对水生生物的影响。
图6 a-c水蚤甲壳的超薄切片透射电镜图像。d-f 消化道部位的透射电子显微镜图像
3、结论
在这项工作中，时间门控装置与聚苯乙烯包被的上转换纳米颗粒，提供了一种实时原位活体观察单个活浮游生物对纳米塑料的摄取，累积和吸收的策略，该方法具有高灵敏度和非常低的检测极限(200 pg/视野，SNR=3.0)。本工作通过时间门控方法观察和记录了大型蚤对纳米塑料的摄取和排泄过程。发现纳米塑料在最初几分钟内迅速积聚在肠道中，并在几个小时内沉积在甲壳和身体组织中。在暴露于500μg/L的纳米塑料24小时后，排泄过程显示出非常快速的动力学，在约10分钟内排出数纳克的NPs。然而，在48小时排泄后，大型蚤体内仍保留了~3ng的塑料纳米颗粒，这表明大型蚤作为滤食性动物倾向于保留纳米塑料。生物富集行为提醒我们注意纳米塑料对环境的潜在风险。
1. Pinheiro, H. T.; MacDonald, C.; Santos, R. G.; Ali, R.; Bobat, A.; Cresswell, B. J.; Francini-Filho, R.; Freitas, R.; Galbraith, G. F.; Musembi, P.; Phelps, T. A.; Quimbayo, J. P.; Quiros, T. E. A. L.; Shepherd, B.; Stefanoudis, P. V.; Talma, S.; Teixeira, J. B.; Woodall, L. C.; Rocha, L. A. Plastic Pollution on the World’s Coral Reefs. Nature 2023, 619, 311-316.
2. Zangmeister, C. D.; Radney, J. G.; Benkstein, K. D.; Kalanyan, B. Common Single-Use Consumer Plastic Products Release Trillions of Sub-100 Nm Nanoparticles Per Liter into Water During Normal Use. Environmental Science & Technology 2022, 56, 5448-5455.
3. Detection of Various Microplastics in Human Stool. Annals of Internal Medicine 2019, 171, 453-457.
4. Yan, Z.; Liu, Y.; Zhang, T.; Zhang, F.; Ren, H.; Zhang, Y. Analysis of Microplastics in Human Feces Reveals a Correlation between Fecal Microplastics and Inflammatory Bowel Disease Status. Environmental Science & Technology 2022, 56, 414-421.
5. Das, A. The Emerging Role of Microplastics in Systemic Toxicity: Involvement of Reactive Oxygen Species (Ros). Sci. Total Environ. 2023, 895, 165076.
4、解决方案
由中智科仪自主研发生产的逐光IsCMOS像增强相机采用高量子效率低噪声的2代Hi-QE以及第3代GaAs像增强器，光学门宽短至500皮秒;全分辨率帧速高达98幅/秒;内置皮秒精度的多通道同步时序控制器，由SmartCapture软件进行可视化时序设置，完全适合时间分辨快速等离子现象。
1. 500皮秒光学快门
以皮秒精度捕捉瞬态现象，并大幅降低背景噪声。
2.高采样频率
逐光IsCMOS相机目前全分辨率下可达98帧，提供高速数据采集速率，同时可提供实验效率。此外设置使用其中16行的区域下，可以达到1300帧以上。
3.准确的时序控制
逐光IsCMOS像增强相机具有三路独立输入输出的时序同步控制器，最短延迟时间为10皮秒，内外触发设置可实现与激光器以及其他装置精准同步。
4. 创新“零噪声”技术
得益于单光子信号的准确识别，相机的暗噪声及读出噪声被完全去除。
